双孢蘑菇菌种生产操作规程

1　范围

本标准规定了双孢蘑菇母种、原种和栽培种的制种要求、质量要求、抽样方法、试验方法、质量评定程序和容器及标志、保藏、运输等内容。

本标准适用于在嘉善县行政区域内生产、经销、使用双孢蘑菇菌种的单位利个人。

2　规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T12728         食用菌术语

GB l5569          农业植物调运检疫规程

NY/T 1742         食用菌菌种通用技术要求

3　术语和定义

GB/T12728确立的以及下列术语和定义适用于本标准。

3.1　母种(一级菌种，俗称试管菌种)

由孢子、子实体组织、菇基质菌丝分离纯化，并在专用培养基上繁殖的转管扩繁3-5次以内的菌种。

3.2　原种(二级菌种)

由母种移植到专用培养基繁殖的菌种。

3.3　栽培种(三级菌种、俗称生产种)

由原种移植到培养基繁殖的菌种。

3.4　脱壁

因菌龄过长或其他非侵染性因子导致的菌丝体萎缩，菌丝变淡，培养基收缩而脱离瓶峥。

3.5　抑菌圈

由不良环境发瞢或变淡的菌丝圈。

4　制种

4.1　菌种确定

通过合法途径引进的并按国家规定允许用于生产的菌种。

4.2　母种扩管

4.2.1　培养基：PDA(马铃薯、葡萄糖琼脂培养基)等，配方见附录A(规范性附录)。

4.2.2　经出菇鉴定合格的母种在无菌条件下按1：30进行转管，置23-25℃恒温培养菌丝满管后即为母种，对暂不使用的母种贴好标签，置4-5℃环境中保存。

4.3　原种

4.3.1　培养基

生产原种的培养基宜选用附录A提出的配方。

4.3.1.1　粪草培养基(配方见附录A)

制作方法是将稻草(或麦草)混堆充分发酵至棕红色，取腐熟的稻麦草晒干备用。把发酵麦秆切短，大约为2-3cm，加入粉碎牛粪粉、石膏、石灰，充分拌匀，加水调湿使培养基均匀吸水至含水量达到65％左右，随后铲成一堆让培养基水分平衡15h左右，即可装瓶。

4.3.1.2　发酵棉籽壳培养基(配方见附录A)

制作方法是棉籽壳、牛粪粉、石膏、尿素(或复合肥)，过磷酸钙，用石灰调节PH值至9，充分拌匀拌湿后，建堆发酵，堆宽1.5m，高1.2-1.5m，长度根据数量而定，当料湿达65-70℃时可进行第一次翻堆，以后一般3-4d翻堆1次，料湿控制在55—60℃之间，每次翻堆时根据需要补充1％石灰水，含水量控制在65％-70％之间，经过4-5次翻堆，棉籽壳长满大量高湿放线菌。发酵棉籽壳晒干并干燥贮藏备用。制种时把腐熟棉籽壳按配方要求与其他辅料充分拌匀，用1％石灰水调节PH值为9、含水量达5孓60％左右，堆成一堆使水分充分平衡均匀，装瓶前再搅拌均匀。

4.3.1.3　粮食培养基(配方见附录A)

制作方法是在制种的前一天下午，将麦粒或谷粒浸泡在2％石灰水，PH在11以上，大小麦一般泡10-12h，谷粒20h左右，以浸透为标准，将把浸透的麦捞起沥去石灰水，用清水冲洗干净、沥干，加入预湿辅料拌匀后即可装瓶。

4.3.2　装瓶

装料时要随加随压实，松紧适度，上下均匀一致，四周无穿隙，瓶肓装结实，粪草或发酵棉籽壳培养的一般装到瓶肓为宜(约350g)，在麦粒或谷粒上面加盖预先准备的已发酵好的封口材料。料装好后塞上棉塞，松紧度适当，以握棉塞提起，瓶不掉下且棉塞碰不到料面为准。

4.3.3　灭菌

灭菌宜采用高压消毒锅进行蒸汽高压灭菌，粪草及棉籽壳培养基压力为0.2-0.25Mpa，灭菌时间为3h，粮食菌种培养压力为0.18Mpa，灭菌时间为2h。

4.3.4　接种

消毒好的瓶子，放在干净室内冷却，当温度下降至30℃以下时将瓶子搬入无菌箱或无菌室内，随后使用气雾剂对空间及瓶表面进行消毒，消毒后30n血即可开始接种。按无菌操作的方法接种。

4.4　栽培种

4.4.1　培养基：按4.3.1规定执行。

4.4.2　装料：按4.3.2规定执行。

4.4.3　灭菌：按4.3.3规定执行。

4.4.4　接种：按4.3.4规定执行。

每瓶原种可接栽培种50～60瓶。

4.4.5　培养按4.3.5规定执行。

5　菌种质量要求

菌种质量应符合表1规定。

表1  菌种质量要求

6　抽样

6.1　组批：以同一分离转接时间、方法、培养条件的母种、原种为一批。以同一种源、制作方法、培养条件的栽培种为一批。

6.2　抽样方法：同一批母种应逐支检验。原种、栽培种分别按批量的5％、1％随机抽样，抽样数量不得少于20瓶。

7　试验方法

7.1　种性

母种：将优良的母种提早做成原种，并进行栽培试验，经出菇鉴定后，出菇正常者，方可作为母种。出菇鉴定按NY/T 1742中的规定进行。

原种、栽培种：查母种供应单位的出菇试验记录及鉴定结果。

7.2　菌丝状态、菌丝自溶、吐黄水

目测

7.3　杂菌、害虫

目测：如不能定论的，再镜检。

7.4　积水、脱壁、发菌程度、抑菌圈

目测

7.5　菌龄

查生产记录。

8　质量评定程序

8.1　合格判别

同一样品中，菌丝状态、害虫、杂菌、积水、脱壁、抑菌圈、吐黄水、菌龄、菌皮八个项目中有一项不合格，就判不合格。根据检验结果，计算出样品中的合格数和不合格数。当不合格数<5％时，判该批为合格；当不合格数>5％时，判该批不合格。对不合格批可作必要的技术处理后，按6.2重新抽样检验。

8.2　质量仲裁

供需双方对质量有异议时，双方可协商解决或由菌种管理站进行仲裁。

9　容器及标志、保藏、运输

9.1　容器

9.1.1　母种采用Ф18mm—20mm×200mm的玻璃试管。

9.1.2　原种拟采用750m1玻璃菌种瓶。

9.1.3　栽培种拟采用玻璃菌种瓶。

9.1.4　各级菌种宜采用棉塞进行容器封口。

9.2　标志

出售的菌种须贴有标签，标签应清晰、牢固，具体标明菌种名称、级别、生产单位名称及地址、接种日期、有效期限，并附合格证明。

9.3　保存

9.3.1　母种一般在冰箱中保存，保存湿度4℃-5℃，保存期超过6个月，则应转管复壮。

9.3.2　原种、栽培种应在干燥(空气相对湿度50％-70％)通风、清洁、避光的室内保存。原种温度宜在2℃以下，栽培种温度宜在25℃左右。

9.4　运输

9.4.1　向外调运的菌种，应按GBl5569进行检疫，办理检疫证书。

9.4.2　栽培种应避高温烈日运输。

9.4.3　装车后应及时启动，在运输中需有防震、防晒、防潮、防污染措施。

附录A

(规范性附录)

培养基配方

A.1.1　母种培养基配方

A.1.1.1　马铃薯酵母膏培养基(PDA)

马铃薯(去皮)200克、葡萄糖20克、琼脂18-20克、水1000毫升。

A.1.1.2　堆肥浸汁葡萄糖培养基

堆肥(干)100克、葡萄糖20克、琼脂18-20克、水1000毫升。

A.1.1.3　完全培养基(CM)

硫酸镁0.5克、葡萄糖20克、磷酸二氢钾0.46克、磷酸氢二钾1克、蛋白胨2克、琼脂18-20克、水1000毫升。

A.1.2　二级和三级种培养基

A.1.2.1　粪草培养基(适合二级种)

发酵麦秆72％、发酵牛粪20％、麸皮5％、糖1％、磷酸钙1％、石膏1％、含水量62-65％。

A.1.2.2　牛粪粉培养基(适合二级种)

发酵牛粪98％、麸皮5％、碳酸钙2％、含水量62-65％。

A.1.2.3　棉籽壳培养基(适合二、三级种)

发酵棉籽壳72％、牛粪粉10％、河泥粉15％、过磷酸钙1％、碳酸钙1％、石灰1％、含水量62-65％。

A.1.2.4　谷粒培养基(适合二、三级种)

麦粒(小麦、大麦、谷粒)72％、碳酸钙2％、石膏1％、牛粪粉10％、河泥粉15％、含水量62-65％。

A.1.2.5　小麦谷粒培养基(适合三级种)

小麦88％、稻谷10％、碳酸钙2％。

A.1.2.6　小麦牛粪粉培养基(适合三级种)

小麦88％、牛粪粉10％、碳酸钙2％。